SF-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402334-ACT

NR5A1 kodiert den steroidogenen Faktor 1 (SF-1), einen orphanen nukleären Rezeptor, der als übergeordneter transkriptioneller Masterregulator der Entwicklung von Nebenniere und Gonaden, der Biosynthese von Steroidhormonen sowie der Homöostase der Reproduktionsachse fungiert. SF-1 koordiniert Gennetzwerke, die Cholesterintransport und die Expression steroidogener Enzyme steuern, und integriert Signaleingänge, die endokrine Differenzierungsprogramme prägen. In der menschlichen Biologie ist eine veränderte NR5A1-Aktivität mit Störungen der Geschlechtsentwicklung, eingeschränkter Gonadenfunktion und Phänotypen einer Nebenniereninsuffizienz verknüpft und ist zudem für die Biologie endokriner Tumoren relevant. Da SF-1 die Festlegung der Zelllinie (Lineage Specification) und hormonbezogene Transkriptionsschaltkreise moduliert, wird es häufig eingesetzt, um endokrine Zellschicksalsentscheidungen, Steroidogenesewege und Abhängigkeiten von Kofaktoren nukleärer Rezeptoren zu untersuchen.

SF-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NR5A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SF-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NR5A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NR5A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SF-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NR5A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SF-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SF-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NR5A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.