Plasmide CRISPR d'Activation (h) Sec61β: sc-402791-ACT

SEC61B code la protéine Sec61β, une petite sous-unité du translocon hétérotrimérique Sec61 intégré à la membrane du réticulum endoplasmique (RE), qui assure l’import co-traductionnel des protéines et l’insertion des protéines membranaires. En couplant l’arrimage des ribosomes au RE et en se coordonnant avec la voie de la particule de reconnaissance du signal (SRP), Sec61β contribue à la protéostasie de la voie sécrétoire et aux processus de contrôle qualité du RE liés à la réponse aux protéines mal repliées (UPR) et à la dégradation associée au RE (ERAD). Des perturbations du trafic dépendant du translocon peuvent influencer la maturation de récepteurs, de canaux et de facteurs sécrétés, ce qui fait de SEC61B une cible pertinente pour l’étude du stress du RE, des déséquilibres du protéome et, plus largement, des mécanismes qui façonnent l’homéostasie cellulaire. Comme le complexe Sec61 affecte également la présentation antigénique et la biogenèse de régulateurs immunitaires et métaboliques, SEC61B est fréquemment examiné dans des criblages de génomique fonctionnelle explorant l’adaptation au stress et les phénotypes liés à la gestion des protéines.

Sec61β Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SEC61B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Sec61β Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SEC61B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SEC61B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Sec61β. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SEC61B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Sec61β au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Sec61β dans les cellules tumorales présentant une expression de SEC61B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.