Plasmide CRISPR d'Activation (h) Sec61α1: sc-402222-ACT

SEC61A1 code la sous-unité alpha du translocon Sec61, un canal conservé de conduction des protéines situé dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) et assurant l’insertion co-traductionnelle et la translocation des polypeptides naissants. Sec61α1 agit à l’interface entre l’ancrage du ribosome, la reconnaissance des peptides signaux et le contrôle qualité des protéines dans le RE, reliant la biogenèse de la voie sécrétoire à la protéostasie et à la réponse aux protéines mal conformées (UPR). En gouvernant l’entrée dans le RE des protéines sécrétées et membranaires, SEC61A1 influence des processus tels que la maturation des glycoprotéines, la dégradation associée au RE (ERAD) et la signalisation du stress cellulaire. Une perturbation de la capacité de translocation vers le RE est pertinente pour des pathologies dues à un déséquilibre de la protéostasie et à un dysfonctionnement de la voie sécrétoire, ce qui justifie son étude dans des contextes de survie cellulaire, de différenciation et d’adaptation au stress.

Sec61α1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SEC61A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Sec61α1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SEC61A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SEC61A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Sec61α1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SEC61A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Sec61α1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Sec61α1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SEC61A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.