Plasmide CRISPR d'Activation (h) SDHD: sc-403276-ACT

Le gène humain **SDHD** code la petite sous-unité D, intégrale à la membrane, de la succinate déshydrogénase (complexe II mitochondrial). Il s’agit d’un composant essentiel qui ancre le domaine catalytique de la SDH dans la membrane interne mitochondriale et soutient le transfert d’électrons du succinate vers l’ubiquinone. En reliant le cycle de l’acide tricarboxylique (cycle de Krebs, TCA) à la chaîne respiratoire, SDHD contribue à la phosphorylation oxydative, à l’équilibre rédox cellulaire et à l’homéostasie des métabolites, notamment via la régulation des niveaux de succinate. Une perturbation ou une expression altérée de SDHD peut favoriser une dysfonction mitochondriale et une accumulation de succinate, remodelant la signalisation au sein des voies de détection de l’oxygène et de réponse au stress, telles que les programmes transcriptionnels liés à HIF. SDHD présente une forte pertinence pathologique dans la biologie des tumeurs déficientes en SDH et dans la dérégulation du métabolisme mitochondrial, ce qui en fait une cible clé pour l’étude des relations entre génotype et métabolisme.

SDHD Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SDHD sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SDHD Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SDHD dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SDHD, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SDHD. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SDHD natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SDHD au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SDHD dans les cellules tumorales présentant une expression de SDHD silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.