Plasmide CRISPR d'Activation (h) SCCA1: sc-403601-ACT

SERPINB3 code l’antigène 1 du carcinome épidermoïde (SCCA1), un inhibiteur intracellulaire de sérine protéases de la famille des serpines, qui module l’homéostasie protéique dépendante des protéases (protéostase) ainsi que les réponses au stress des épithéliums. SCCA1 peut freiner l’activité de protéases de type cathepsine et chymase, influençant l’intégrité lysosomale, la présentation d’antigènes et des programmes de signalisation apoptotiques ou inflammatoires dans les épithéliums différenciés. Une expression dérégulée de SERPINB3 a été associée au remodelage épithélial et à des phénotypes liés à l’immunité observés dans des contextes de malignité squameuse, ce qui en fait un marqueur utile et un nœud fonctionnel pour étudier l’inflammation associée aux tumeurs et les voies de survie cellulaire. Dans des modèles cellulaires, la perturbation de SERPINB3 est couramment évaluée en parallèle de voies régulant le stress oxydatif, la signalisation des cytokines et la différenciation épithéliale.

SCCA1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SERPINB3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SCCA1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SERPINB3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SERPINB3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SCCA1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SERPINB3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SCCA1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SCCA1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SERPINB3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.