SAV1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425662-ACT

Sav1 kodiert das Salvador-Familienprotein 1 mit WW-Domänen (SAV1), eine Gerüstkomponente des Hippo-Signalwegs, die mit MST1/2- und LATS-Kinasen zusammenwirkt, um die Aktivität von YAP/TAZ sowie die transkriptionellen Outputs zu regulieren, die Proliferation, Apoptose und Gewebewachstum steuern. In Mauszellen unterstützt SAV1 die Kontaktinhibition und die epitheliale Homöostase, indem es den Zusammenbau von Kinasekomplexen und Phosphorylierungskaskaden koordiniert, die wachstumsfördernde Genexpressionsprogramme begrenzen. Eine Fehlregulation der SAV1-gekoppelten Hippo-Signalgebung ist in experimentellen Modellen mit einer veränderten Kontrolle der Organgröße, aberranten Regenerationsantworten und tumorassoziierten Phänotypen verbunden, was Sav1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung von Wachstumskontrolle und Mechanotransduktion macht. SAV1 ist außerdem mit der Zytoskelettdynamik und der Signalübertragung an Zell-Zell-Kontakten verknüpft und bietet damit einen Ansatz, um zu untersuchen, wie Zellpolarität und mechanische Signale den Transkriptionszustand beeinflussen.

SAV1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Sav1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SAV1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Sav1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Sav1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SAV1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Sav1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SAV1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SAV1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Sav1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.