Plasmide CRISPR d'Activation (m) Sar1B: sc-425994-ACT

Sar1b code la petite GTPase SAR1B, un régulateur central de la biogenèse des vésicules à manteau COPII aux sites de sortie du réticulum endoplasmique. En alternant entre les états liés au GDP et au GTP, SAR1B initie la courbure membranaire et recrute les composants COPII afin de contrôler le trafic RE‑Golgi des protéines sécrétées et membranaires, y compris des cargaisons associées aux lipoprotéines. Le transport dépendant de Sar1b s’intègre à la protéostasie du RE, à la gestion des lipides et à la réponse aux protéines mal repliées, ce qui le rend pertinent pour l’étude de l’absorption intestinale des lipides, de la sécrétion des hépatocytes et de l’homéostasie métabolique. Une altération de la fonction de SAR1B est associée à des défauts d’exportation des chylomicrons et de distribution systémique des lipides, ce qui étaye son utilisation comme nœud mécanistique dans des modèles de dyslipidémie et de stress des organites.

Sar1B Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Sar1b sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Sar1B Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Sar1b dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Sar1b, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Sar1B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Sar1b natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Sar1B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Sar1B dans les cellules tumorales présentant une expression de Sar1b silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.