Plasmide CRISPR d'Activation (h) Sar1B: sc-412122-ACT

Le gène humain **SAR1B** code Sar1B, une petite GTPase COPII qui initie le transport du réticulum endoplasmique (RE) vers l’appareil de Golgi en recrutant Sec23/24 et en favorisant le bourgeonnement de vésicules à partir des sites de sortie du RE. Grâce à une régulation fine de la liaison au GTP et de son hydrolyse, Sar1B coordonne la sélection des cargos et la courbure membranaire, soutenant la sécrétion, le trafic des lipoprotéines et, plus largement, les réseaux de protéostase liés aux réponses au stress du RE. La perturbation des dynamiques COPII dépendantes de SAR1B a été associée à des troubles congénitaux de l’absorption des lipides et de la sécrétion des chylomicrons, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la gestion intestinale des lipides et de l’homéostasie lipidique systémique. Sar1B sert également de nœud modèle pour interroger la régulation de la voie sécrétoire, les points de contrôle du trafic membranaire et la communication entre organites dans les cellules humaines.

Sar1B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SAR1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Sar1B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SAR1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SAR1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Sar1B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SAR1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Sar1B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Sar1B dans les cellules tumorales présentant une expression de SAR1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.