Plasmide CRISPR d'Activation (h) Sar1a: sc-404190-ACT

Le gène humain **SAR1A** code Sar1a, une petite GTPase associée au complexe COPII qui initie le bourgeonnement de vésicules de transport à partir du réticulum endoplasmique et soutient le trafic du RE vers l’appareil de Golgi. En alternant entre les états liés au GDP et au GTP, Sar1a recrute les composants de la coque Sec23/24 et Sec13/31 afin de réguler la sélection du cargo, la courbure des vésicules et le flux de sécrétion. Le trafic dépendant de SAR1A s’articule avec des voies de protéostasie, notamment la signalisation du stress du RE et la réponse aux protéines mal repliées (UPR), influençant la prise en charge cellulaire des protéines membranaires et sécrétées. Une dynamique dérégulée de la voie sécrétoire et de l’homéostasie du RE est fréquemment impliquée dans des phénotypes associés aux maladies, tels qu’une modification du dépôt de matrice extracellulaire, un trafic aberrant des récepteurs et une signalisation d’adaptation au stress dans les cellules transformées.

Sar1a Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SAR1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Sar1a Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SAR1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SAR1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Sar1a. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SAR1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Sar1a au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Sar1a dans les cellules tumorales présentant une expression de SAR1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.