Sam 68 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401378-ACT

KHDRBS1 kodiert Sam 68 (Src-associated in mitosis 68 kDa), ein RNA-bindendes Protein der STAR-Familie, das Signaltransduktion mit dem RNA-Stoffwechsel koppelt. Sam 68 reguliert alternatives Spleißen, mRNA-Export, -Stabilität und -Translation durch Bindung an U/A-reiche Elemente und wird dynamisch durch Phosphorylierung sowie andere posttranslationale Modifikationen gesteuert. Es ist an Signalwegen beteiligt, die mit Zellzyklusprogression, DNA-Schadensantworten und Zytoskelett-Remodeling verknüpft sind, und integriert Signale aus Src-Familien-Kinasen und der MAPK-Signalgebung. Eine dysregulierte Sam-68-Aktivität wurde mit veränderten Spleißprogrammen und aberranten Genexpressionsmustern in mehreren Krebs- und neurodegenerationsrelevanten Modellen in Verbindung gebracht und unterstützt seine Nutzung als mechanistischer Knotenpunkt in der Forschung zur RNA-Prozessierung.

Sam 68 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KHDRBS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Sam 68 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KHDRBS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KHDRBS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Sam 68-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KHDRBS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Sam 68-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Sam 68-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KHDRBS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.