Plasmide CRISPR d'Activation (h) RPB2: sc-402591-ACT

POLR2B code pour RPB2, la deuxième plus grande sous-unité catalytique de l’ARN polymérase II, qui synthétise l’ARNm et de nombreux ARN non codants essentiels à l’expression génique chez les eucaryotes. RPB2 contribue à l’ouverture du promoteur, à l’incorporation des nucléotides et à la processivité de la transcription, en couplant la transcription au traitement co‑transcriptionnel des ARN et à la régulation de la chromatine. En tant que composant central de la machinerie transcriptionnelle basale, POLR2B soutient des voies qui gouvernent la progression du cycle cellulaire, la différenciation et les réponses au stress, via un contrôle global de la production transcriptionnelle. Le dérèglement de la fonction de l’ARN polymérase II et de l’homéostasie transcriptionnelle est largement pertinent pour la biologie des maladies prolifératives et neurodéveloppementales, où des programmes d’expression génique altérés constituent un mécanisme central.

POLR2B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POLR2B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

POLR2B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POLR2B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POLR2B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de POLR2B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POLR2B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de POLR2B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie POLR2B dans les cellules tumorales présentant une expression de POLR2B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.