Plasmide CRISPR d'Activation (h) robo4: sc-401856-ACT

ROBO4 (récepteur 4 d’orientation axonale de type roundabout) code un récepteur transmembranaire enrichi dans l’endothélium, qui contribue au maintien de la stabilité vasculaire et régule le comportement angiogénique. Robo4 module la dynamique du cytosquelette et la fonction de barrière endothéliale en influençant les signalisations d’orientation et d’adhérence, notamment via des interactions avec les signaux SLIT et des voies liées à la perméabilité induite par le VEGF. Par ces mécanismes, ROBO4 est largement impliqué dans des processus tels que le bourgeonnement vasculaire, l’inflammation vasculaire et le trafic leucocytaire au sein de la microvascularisation. Une expression ou une signalisation de ROBO4 dérégulée a été associée à une angiogenèse pathologique et à une intégrité vasculaire altérée, observées dans divers phénotypes vasculaires cardiovasculaires et associés aux tumeurs.

robo4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ROBO4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

robo4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ROBO4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ROBO4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de robo4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ROBO4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de robo4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie robo4 dans les cellules tumorales présentant une expression de ROBO4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.