robo2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-435289-ACT

Mouse Robo2 kodiert den Roundabout-Leitrezeptor Robo2, ein transmembranes Protein, das Slit-Liganden bindet und während der Entwicklung des Nervensystems die Axonführung, neuronale Migration und das Neuritenwachstum reguliert. Die durch Robo2 vermittelte Signalübertragung beeinflusst über Rho-GTPase-Signalwege der Rho-Familie die Zytoskelettdynamik und die Zellmotilität und unterstützt so die räumliche Musterbildung und Konnektivität im ZNS und PNS. Über die Neuroentwicklung hinaus ist Robo2 an der Epithelmorphogenese und Organogenese beteiligt; genetische und Expressionsstudien bringen eine veränderte ROBO2-Aktivität mit angeborenen Fehlbildungen und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Zusammenhang. Diese Funktionen machen Robo2 zu einem relevanten Ziel, um Signalübertragung durch Leitsignale, den Aufbau neuronaler Schaltkreise und Entwicklungsmechanismen in Mausmodellen zu untersuchen.

robo2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Robo2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

robo2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Robo2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Robo2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen robo2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Robo2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von robo2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des robo2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Robo2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.