Plasmide CRISPR d'Activation (h) robo1: sc-402263-ACT

ROBO1 code le récepteur d’orientation axonale Roundabout 1 (robo1), un récepteur transmembranaire des ligands SLIT qui régule le guidage des axones, la migration neuronale et l’organisation des tissus via la signalisation SLIT–ROBO. Dans les cellules humaines, ROBO1 influence la dynamique du cytosquelette et la motilité cellulaire via des voies en aval impliquant les petites GTPases de la famille Rho, avec un impact sur des processus tels que la migration directionnelle et la formation de frontières tissulaires. Une activité ou une expression dérégulée de ROBO1 a été associée à une signalisation développementale aberrante et à des programmes d’invasion cellulaire altérés, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des mécanismes du neurodéveloppement et de la biologie tumorale. ROBO1 est également utilisé comme marqueur et nœud fonctionnel dans l’exploration des réseaux de signalisation des signaux de guidage et de leurs interactions avec les voies des facteurs de croissance et de l’adhérence.

robo1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ROBO1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

robo1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ROBO1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ROBO1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de robo1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ROBO1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de robo1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie robo1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ROBO1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.