RNH1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404619-ACT

RNH1 umano (inibitore 1 della ribonucleasi/angiogenina) codifica una proteina con ripetizioni ricche in leucina che si lega e inibisce i membri della superfamiglia RNasi A, in particolare l’angiogenina (ANG), modulando così il metabolismo dell’RNA e i programmi di adattamento allo stress. Limitando l’attività ribonucleolitica di ANG e il suo ruolo nel clivaggio dell’tRNA indotto dallo stress, RNH1 influenza il controllo della traduzione e risposte cellulari più ampie a segnali ossidativi e infiammatori. RNH1 è stato inoltre associato all’omeostasi redox attraverso effetti sulla suscettibilità cellulare alle specie reattive dell’ossigeno e sulla sopravvivenza in condizioni di stress. La disregolazione della segnalazione RNasi/ANG e delle vie dell’RNA legate allo stress è rilevante per la neurodegenerazione, la biologia dei tumori e gli stati infiammatori, rendendo RNH1 un nodo utile per studi meccanicistici di fenotipi guidati dall’RNA.

RNH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RNH1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RNH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RNH1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RNH1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RNH1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RNH1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RNH1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RNH1 nelle cellule tumorali con espressione di RNH1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.