Plasmide CRISPR d'Activation (h) RNF8: sc-401909-ACT

RNF8 code une ligase E3 de l’ubiquitine qui agit comme un amplificateur précoce de la signalisation dans la réponse aux dommages de l’ADN, en catalysant l’ubiquitination au niveau des cassures double brin afin de coordonner le recrutement des facteurs de réparation. Grâce à ses interactions avec MDC1 et à un ancrage dépendant de la phosphorylation sur la chromatine endommagée, RNF8 favorise l’assemblage, dépendant de l’ubiquitine, de médiateurs en aval tels que 53BP1 et BRCA1, influençant le choix de la voie entre la jonction d’extrémités non homologues et la recombinaison homologue. L’activité de RNF8 relie également la surveillance du génome au contrôle des points de contrôle du cycle cellulaire et au remodelage de la chromatine, contribuant au maintien de la stabilité génomique en conditions de stress réplicatif. Une signalisation RNF8 dérégulée a été associée à une capacité de réparation de l’ADN altérée et à des phénotypes d’instabilité génomique pertinents pour la biologie du cancer et la sensibilité aux agents génotoxiques.

RNF8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RNF8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RNF8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RNF8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RNF8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RNF8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RNF8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RNF8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RNF8 dans les cellules tumorales présentant une expression de RNF8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.