Plasmide CRISPR d'Activation (h) RNF31: sc-412436-ACT

RNF31 code une ligase E3 de l’ubiquitine qui constitue un composant catalytique du complexe d’assemblage des chaînes d’ubiquitine linéaires (LUBAC), favorisant l’ubiquitination Met1‑liée d’intermédiaires clés de signalisation. En régulant les cascades de signalisation de NF‑κB, du récepteur du TNF et de l’immunité innée, RNF31 contribue à coordonner l’expression des gènes inflammatoires, la survie cellulaire et les réponses au stress. Son activité influence la protéostasie et la terminaison des signaux en modulant les interactions protéine‑protéine dépendantes de l’ubiquitine et la stabilité des complexes. Une dysrégulation de la fonction de RNF31 a été associée à une signalisation immunitaire aberrante et au renforcement de voies oncogéniques dans de multiples contextes pathologiques, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques des réseaux de signalisation pilotés par l’ubiquitine.

RNF31 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RNF31 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RNF31 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RNF31 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RNF31, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RNF31. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RNF31 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RNF31 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RNF31 dans les cellules tumorales présentant une expression de RNF31 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.