Plasmide CRISPR d'Activation (h) RNF181: sc-403952-ACT

RNF181 code une ligase E3 à doigt RING qui favorise l’ubiquitination des substrats afin de réguler le renouvellement des protéines et la sortie des voies de signalisation. Par une modulation dépendante de l’ubiquitine d’intermédiaires clés de signalisation, RNF181 est impliquée dans le contrôle des réponses immunitaires et inflammatoires, l’adaptation au stress cellulaire et le maintien de l’homéostasie protéique. Une expression ou une activité altérée de RNF181 peut perturber l’amplitude et la cinétique des voies, ce qui relie sa régulation à des mécanismes pertinents pour la signalisation oncogénique, les dysfonctionnements immunitaires et d’autres situations où la signalisation par l’ubiquitine est dérégulée. Ces caractéristiques font de RNF181 un nœud utile pour disséquer le contrôle des voies médié par l’ubiquitine et les changements d’état transcriptionnel dans des modèles de cellules humaines.

RNF181 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RNF181 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RNF181 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RNF181 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RNF181, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RNF181. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RNF181 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RNF181 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RNF181 dans les cellules tumorales présentant une expression de RNF181 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.