Plasmide CRISPR d'Activation (h) RNase H1: sc-402850-ACT

Le gène humain **RNASEH1** code la RNase H1, une endonucléase nucléaire et mitochondriale qui dégrade spécifiquement le brin ARN des hybrides ARN:ADN, facilitant l’élimination des R-loops au cours de la transcription et de la réplication. En traitant les amorces d’ARN et en résolvant des intermédiaires hybrides, la RNase H1 contribue à la stabilité du génome, à la réplication et à la réparation de l’ADN mitochondrial, ainsi qu’à la coordination des conflits réplication–transcription. Une dérégulation du renouvellement des hybrides ARN:ADN a été associée au stress réplicatif et à l’activation de la signalisation des dommages à l’ADN, faisant de **RNASEH1** un point d’intérêt pour étudier les voies reliant le métabolisme des acides nucléiques aux réponses cellulaires au stress. Une altération de la fonction de la RNase H1 est également associée à des phénotypes de dysfonction mitochondriale, permettant d’explorer les mécanismes de maintien du génome mitochondrial dans des contextes pertinents pour la maladie.

RNase H1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RNASEH1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RNase H1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RNASEH1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RNASEH1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RNase H1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RNASEH1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RNase H1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RNase H1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RNASEH1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.