Plasmide CRISPR d'Activation (h) RIG-I: sc-400812-ACT

DDX58 code pour l’hélicase ARN cytosolique RIG-I, un récepteur clé de reconnaissance des motifs (PRR) qui détecte les courts ARN double brin ainsi que les ARN viraux portant une extrémité 5′-triphosphate. Après liaison au ligand, RIG-I transmet le signal via MAVS pour activer les voies IRF3/IRF7 et NF-κB, induisant des interférons de type I et des cytokines pro-inflammatoires dans le cadre de la défense antivirale innée. Cet axe s’inscrit dans des programmes plus larges de gènes stimulés par l’interféron, un remodelage immunométabolique, et un dialogue avec l’autophagie et l’apoptose lors du stress cellulaire. Une signalisation RIG-I dérégulée a été associée à une réponse antivirale altérée et à des phénotypes inflammatoires pertinents pour la biologie des infections et les mécanismes des maladies à médiation immunitaire.

RIG-I Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DDX58 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RIG-I Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DDX58 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DDX58, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RIG-I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DDX58 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RIG-I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RIG-I dans les cellules tumorales présentant une expression de DDX58 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.