Plasmide CRISPR d'Activation (h) RIC-3: sc-405366-ACT

Le gène humain RIC3 code RIC-3, une chaperonne résidente du réticulum endoplasmique qui favorise le repliement, l’assemblage et le trafic de certains canaux ioniques ligand-dépendants, en particulier les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine. En contrôlant la maturation des récepteurs et leur expression à la surface cellulaire, RIC-3 influence la transmission synaptique cholinergique, l’excitabilité neuronale et les programmes de signalisation en aval dépendants du calcium. Une régulation altérée de la biogenèse des récepteurs nicotiniques et du fonctionnement des réseaux cholinergiques a été associée à des phénotypes neurologiques et neuropsychiatriques, faisant de RIC3 un nœud d’intérêt pour étudier la protéostasie des récepteurs et la signalisation synaptique. RIC-3 est également utilisé comme levier mécanistique pour disséquer le contrôle qualité du RE, la stœchiométrie des complexes de canaux et les variations, dépendantes des stimuli, de la disponibilité des récepteurs.

RIC-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RIC3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RIC-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RIC3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RIC3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RIC-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RIC3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RIC-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RIC-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de RIC3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.