RhoB CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400875-ACT

Das humane Gen **RHOB** kodiert **RhoB**, eine prenylierte kleine GTPase aus der Rho-Familie, die als Schnellantwort‑Regulator für den Umbau des Aktinzytoskeletts, den endosomalen Transport und den Turnover von Membranrezeptoren fungiert. RhoB integriert Signale von Wachstumsfaktor‑Rezeptoren und zellulären Stresswegen, um über nachgeschaltete Effektoren, die mit ROCK‑ und Formin‑assoziierten Programmen verknüpft sind, die Dynamik fokaler Adhäsionen, die Zellform und die Motilität zu modulieren. Es trägt zudem zu transkriptionellen und Überlebensantworten bei, indem es die Outputs der MAPK‑ sowie der PI3K/AKT‑Signalwege beeinflusst und so membrannahe Signalgebung mit nukleären Entscheidungen verknüpft. Eine veränderte RHOB‑Expression oder -Regulation wurde mit krebsassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, darunter Invasion, Reaktionen auf Therapienstress und Veränderungen der Apoptoseanfälligkeit, was RHOB für mechanistische Studien zur Plastizität von Tumorzellen und zur Anpassung an die Mikroumgebung relevant macht.

RhoB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RHOB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RhoB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RHOB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RHOB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RhoB-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RHOB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RhoB-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RhoB-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RHOB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.