Rho T1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401601-ACT

RHOT1 kodiert Rho T1 (Miro1), eine atypische GTPase der Rho-Familie, die in der äußeren Mitochondrienmembran verankert ist und den mitochondrialen Transport, die Positionierung sowie die Qualitätskontrolle koordiniert. Über Ca2+-bindende EF-Hand-Domänen und Interaktionen mit Kinesin-/Dynein-Adapterproteinen trägt RHOT1 dazu bei, Mitochondrien an den mikrotubuli-basierten Transport zu koppeln, und reguliert die mitochondriale Dynamik, die bioenergetische Homöostase und die Mitophagie, einschließlich PINK1/PRKN-assoziierter Signalwege. Eine dysregulierte RHOT1-Funktion wird mit einer veränderten mitochondrialen Verteilung und einem beeinträchtigten Organellenumsatz in Verbindung gebracht – Prozesse, die an Neurodegeneration, Neuropathien und anderen Erkrankungen mit mitochondrialen Stressphänotypen beteiligt sind. Als Regulator des mitochondrialen Transports wird RHOT1 häufig in neuronalen Modellen, in oxidativen Stressparadigmen sowie in Assays zur Integrität des mitochondrialen Netzwerks und zur Atmung untersucht.

Rho T1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RHOT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rho T1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RHOT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RHOT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rho T1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RHOT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rho T1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rho T1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RHOT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.