RGMc Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406186-ACT

HFE2 umano codifica la repulsive guidance molecule C (RGMc, nota anche come emojuvelina), una proteina di membrana ancorata tramite glicosilfosfatidilinositolo (GPI) che funge da co-recettore nell’asse di segnalazione BMP/SMAD che controlla la trascrizione epatica dell’epcidina. Modulando la segnalazione dipendente da BMP6 e la fosforilazione a valle di SMAD1/5/8, RGMc integra i segnali di “sensing” del ferro per mantenere l’omeostasi sistemica del ferro attraverso la regolazione dell’esportazione di ferro mediata dalla ferroportina. Un’alterata attività di HFE2/RGMc è associata a una deregolazione dell’espressione dell’epcidina e a fenotipi di sovraccarico di ferro, rendendola un nodo utile per analizzare le reti del metabolismo del ferro. Nei modelli cellulari, la perturbazione dei livelli di RGMc consente studi meccanicistici sulla dinamica della via BMP, sui circuiti regolatori dell’epcidina e sui programmi trascrizionali legati alla gestione del ferro.

RGMc Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HFE2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RGMc Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HFE2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HFE2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RGMc. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HFE2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RGMc nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RGMc nelle cellule tumorali con espressione di HFE2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.