Plasmide CRISPR d'Activation (h) RFX6: sc-408496-ACT

RFX6 (regulatory factor X6) est un facteur de transcription à hélice‑tour‑hélice (« winged‑helix ») qui coordonne les programmes de régulation génique nécessaires au développement du pancréas endocrine et au maintien de l’identité des îlots pancréatiques. Dans les cellules humaines, RFX6 contribue à des réseaux transcriptionnels qui gouvernent la différenciation des cellules bêta, la fonction sécrétoire d’insuline et, plus largement, l’homéostasie du glucose, via la régulation de promoteurs et d’éléments amplificateurs (enhancers) spécifiques de lignée. Une activité altérée de RFX6 a été associée à des troubles endocriniens congénitaux du pancréas et de l’intestin ainsi qu’à des phénotypes liés au diabète, ce qui en fait un nœud pertinent pour l’étude du destin des cellules endocrines, des réponses au stress et de la signalisation métabolique. En tant que régulateur nucléaire, RFX6 est couramment étudié au moyen du profilage d’expression et d’essais basés sur la chromatine afin de définir ses cibles en aval et les circuits transcriptionnels interactifs.

RFX6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RFX6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RFX6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RFX6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RFX6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RFX6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RFX6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RFX6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RFX6 dans les cellules tumorales présentant une expression de RFX6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.