Plasmide CRISPR d'Activation (h) REV1: sc-402251-ACT

Le gène humain **REV1** code une ADN polymérase de la famille Y qui agit comme échafaudage et comme enzyme spécialisée de synthèse translésionnelle (TLS) dans le cadre de la tolérance aux dommages de l’ADN. REV1 coordonne l’insertion en face de bases endommagées et recrute la polymérase ζ via des interactions avec REV7/MAD2L2 et d’autres facteurs de TLS, aidant ainsi les fourches de réplication à contourner des adduits volumineux de l’ADN. Cette activité s’intègre aux réponses au stress réplicatif, à la réparation post-réplication et aux voies de maintien de la stabilité du génome, où une altération de l’équilibre de la TLS peut influencer la mutagénèse et la sensibilité cellulaire au stress génotoxique. REV1 est donc largement étudié dans les mécanismes de réparation de l’ADN, de fidélité de la réplication et d’accumulation de mutations, pertinents pour la biologie du cancer et d’autres affections associées à l’instabilité génomique.

REV1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de REV1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

REV1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus REV1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription REV1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de REV1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus REV1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de REV1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie REV1 dans les cellules tumorales présentant une expression de REV1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.