Repo-Man Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405105-ACT

CDCA2 codifica a Repo-Man, uma subunidade de direcionamento associada à cromatina que recruta a fosfatase proteica 1 (PP1) para os cromossomos mitóticos e para o núcleo em anáfase/telófase, a fim de coordenar eventos de desfosforilação durante a saída da mitose. A Repo-Man contribui para o restabelecimento da arquitetura da cromatina da intérfase e para a regulação dos estados de fosforilação de histonas, conectando a progressão do ciclo celular ao controle transcricional e epigenético. Por seus papéis na segregação cromossômica, no timing de replicação do DNA e na reconstituição do núcleo, a atividade alterada de CDCA2 é frequentemente estudada no contexto de sinalização proliferativa e estabilidade genômica. A desregulação de processos dependentes de Repo-Man–PP1 é relevante em modelos de disfunção de checkpoints do ciclo celular e de remodelamento de cromatina associado ao câncer.

Repo-Man O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDCA2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Repo-Man O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDCA2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDCA2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Repo-Man. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDCA2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Repo-Man no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Repo-Man em células tumorais com expressão de CDCA2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.