REEP5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405007-ACT

REEP5 (Receptor-Expression-Enhancing-Protein 5) ist ein im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiertes Membranprotein, das zur Formgebung von ER-Tubuli beiträgt und die Organisation der Kontaktstellen zwischen ER und Plasmamembran unterstützt. Dadurch fördert es einen effizienten Transport sowie die Oberflächenexpression ausgewählter Rezeptoren und Ionenkanäle. Indem REEP5 die Membrankrümmung und die Dynamik des sekretorischen Weges beeinflusst, wirkt es auf zelluläre Prozesse wie Proteinreifung, Vesikeltransport und die Aufrechterhaltung der ER-Homöostase. Eine veränderte REEP5-Aktivität wurde mit gestörter Rezeptorsignalübertragung und Membranorganisation in Verbindung gebracht und ist daher relevant für Studien zur Zellerregbarkeit, Stressanpassung und zur Umprogrammierung von Signalwegen in krankheitsassoziierten Zuständen. Humanes REEP5 ist somit ein nützliches Ziel, um Mechanismen der ER-Morphogenese und des Rezeptortransports zu untersuchen, die mit Signalnetzwerken und der zellulären Fitness verknüpft sind.

REEP5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen REEP5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

REEP5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des REEP5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der REEP5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen REEP5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native REEP5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von REEP5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des REEP5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem REEP5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.