Plasmide CRISPR d'Activation (h) Recoverin: sc-404106-ACT

Le gène humain RCVRN code la récupérine, une protéine de liaison au Ca2+ de type EF-hand, enrichie dans la rétine, qui agit comme un commutateur Ca2+-myristoyl modulant la phototransduction. Lors des variations du Ca2+ intracellulaire au cours de l’adaptation à la lumière, la récupérine régule l’activité de la rhodopsine kinase (GRK1), influençant la dynamique de phosphorylation de la rhodopsine et les cinétiques de récupération dans les photorécepteurs à bâtonnets et à cônes. Par son rôle dans la signalisation des GPCR, l’homéostasie du Ca2+ et la signalisation visuelle dépendante du cGMP, la récupérine contribue à une transduction du signal rétinien et à une adaptation normales. Des modifications de l’expression ou de l’immunoréactivité de la récupérine ont été associées à des contextes de dysfonctionnement rétinien, faisant de RCVRN une cible pertinente pour des études mécanistiques de la biologie des photorécepteurs et des réseaux de signalisation visuelle.

Recoverin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RCVRN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Recoverin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RCVRN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RCVRN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Recoverin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RCVRN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Recoverin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Recoverin dans les cellules tumorales présentant une expression de RCVRN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.