Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rec8: sc-404152-ACT

Le gène humain REC8 code Rec8, une sous-unité de la cohésine associée à la méiose, qui contribue à établir et à maintenir la cohésion des chromatides sœurs et soutient l’appariement et la recombinaison des chromosomes homologues. En modulant la dynamique du complexe de cohésine, Rec8 participe à la fidélité de la ségrégation chromosomique ainsi qu’à des processus de réparation de l’ADN qui s’inscrivent dans des voies plus larges de stabilité du génome. La dérégulation de composants de la cohésine, y compris des facteurs normalement restreints à la méiose et exprimés de façon ectopique dans des contextes somatiques, est étudiée en lien avec l’aneuploïdie, le stress de réplication et des phénotypes d’instabilité chromosomique pertinents pour la biologie du cancer et de la reproduction. REC8 constitue donc une cible utile pour étudier le contrôle, dépendant de la cohésion, de la recombinaison, de la signalisation des points de contrôle et de l’architecture chromosomique.

Rec8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de REC8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rec8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus REC8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription REC8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rec8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus REC8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rec8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rec8 dans les cellules tumorales présentant une expression de REC8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.