Rbx1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402733-ACT

RBX1 codifica Rbx1, una subunità RING-box delle ligasi E3 ubiquitina Cullin–RING (CRL) che catalizzano il trasferimento di ubiquitina per regolare la degradazione proteasomiale di proteine cellulari chiave. Attraverso CRL1/SCF e complessi correlati, Rbx1 influenza la progressione del ciclo cellulare, le risposte allo stress da replicazione del DNA e la trasduzione del segnale controllando il turnover di cicline, inibitori delle CDK e regolatori di via. L’ubiquitinazione dipendente da RBX1 si interfaccia con la neddilazione delle culline, accoppiando l’attivazione delle CRL alla proteostasi e al controllo dei checkpoint. Un’attività RBX1/CRL deregolata è associata ad alterazioni della proliferazione e della stabilità genomica, rendendo RBX1 un nodo rilevante per lo studio della segnalazione oncogenica, dell’adattamento allo stress e delle vulnerabilità della via dell’ubiquitina nelle cellule umane.

Rbx1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RBX1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rbx1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RBX1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RBX1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rbx1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RBX1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rbx1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rbx1 nelle cellule tumorali con espressione di RBX1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.