Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rbx1: sc-402733-ACT

RBX1 code pour Rbx1, une sous-unité « RING-box » des ligases E3 ubiquitine Cullin–RING (CRL), qui catalysent le transfert d’ubiquitine afin de réguler la dégradation protéasomale de protéines cellulaires clés. Via les complexes CRL1/SCF et apparentés, Rbx1 influence la progression du cycle cellulaire, les réponses au stress de réplication de l’ADN et la transduction du signal en contrôlant le renouvellement des cyclines, des inhibiteurs de CDK et des régulateurs de voies. L’ubiquitination dépendante de RBX1 s’articule avec la neddylation des cullines, reliant l’activation des CRL à la protéostase et au contrôle des points de contrôle. Une activité RBX1/CRL dysrégulée est associée à des altérations de la prolifération et de la stabilité génomique, faisant de RBX1 un nœud pertinent pour étudier la signalisation oncogénique, l’adaptation au stress et les vulnérabilités de la voie de l’ubiquitine dans les cellules humaines.

Rbx1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RBX1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rbx1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RBX1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RBX1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rbx1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RBX1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rbx1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rbx1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RBX1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.