Plasmide CRISPR d'Activation (m) RBP2: sc-431972-ACT

Le gène murin **Kdm5a** code **RBP2**, une déméthylase d’histones de la famille **JARID1** qui enlève les marques **H3K4me3/2** afin de réguler l’activité des promoteurs et des enhancers. En modulant l’accessibilité de la chromatine et le niveau de transcription, RBP2 contribue à coordonner la spécification de lignée, la progression du cycle cellulaire et les programmes de différenciation, et peut interagir avec les réseaux transcriptionnels centraux ainsi qu’avec des complexes de remodelage de la chromatine. Une activité dérégulée de Kdm5a/RBP2 a été associée à des états épigénétiques aberrants liés à des programmes transcriptionnels oncogéniques et à des phénotypes neurodéveloppementaux, ce qui en fait un point d’entrée utile pour étudier le contrôle épigénétique de l’expression génique. Dans les systèmes modèles murins, la manipulation de Kdm5a soutient des recherches mécanistiques sur la régulation des voies dépendante de la chromatine, notamment l’équilibre répression/activation transcriptionnelle et les programmes géniques répondant au stress.

RBP2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Kdm5a sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RBP2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Kdm5a dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Kdm5a, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RBP2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Kdm5a natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RBP2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RBP2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Kdm5a silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.