Plasmide CRISPR d'Activation (m) RBP-Jκ: sc-422626-ACT

Rbpj code pour RBP-Jκ, un facteur de transcription se liant à l’ADN de manière spécifique aux séquences, qui constitue le principal effecteur nucléaire de la voie canonique Notch. Après activation du récepteur Notch, RBP-Jκ orchestre la transition d’une répression transcriptionnelle vers une activation afin de réguler l’engagement de lignée, la différenciation et les décisions de destinée cellulaire dans les compartiments hématopoïétique, neural et immunitaire. Cette voie s’articule avec le remodelage de la chromatine et des programmes transcriptionnels dépendants du contexte, qui façonnent le maintien des cellules souches/progénitrices et l’organisation du développement. Un contrôle transcriptionnel RBP-Jκ/Notch dérégulé est largement étudié dans des modèles de prolifération aberrante, de dysfonctionnement immunitaire et de phénotypes développementaux pertinents pour l’oncogenèse et l’homéostasie tissulaire.

RBP-Jκ Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Rbpj sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RBP-Jκ Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Rbpj dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Rbpj, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RBP-Jκ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Rbpj natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RBP-Jκ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RBP-Jκ dans les cellules tumorales présentant une expression de Rbpj silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.