Plasmide CRISPR d'Activation (h) RBKS: sc-404754-ACT

RBKS (ribokinase) code une kinase cytosolique des glucides qui phosphoryle le D-ribose en ribose-5-phosphate, reliant la voie de sauvetage du ribose à la voie des pentoses phosphates et à la biosynthèse des nucléotides. En régulant les réserves intracellulaires de ribose-5-phosphate, RBKS influence le métabolisme des purines et des pyrimidines, le tamponnage redox via des réactions génératrices de NADPH, ainsi que la capacité proliférative des cellules métaboliquement actives. L’activité de RBKS s’inscrit dans un contrôle plus large des flux de carbone, qui soutient la synthèse d’ADN/ARN et les réponses cellulaires au stress. Les dérégulations du métabolisme du ribose et le remodelage de la voie des pentoses phosphates sont fréquemment étudiés dans le contexte du métabolisme du cancer, de l’activation des cellules immunitaires et des erreurs innées affectant l’homéostasie des nucléotides.

RBKS Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RBKS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RBKS Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RBKS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RBKS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RBKS. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RBKS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RBKS au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RBKS dans les cellules tumorales présentant une expression de RBKS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.