Plasmide CRISPR d'Activation (h) RBCK1: sc-402044-ACT

RBCK1 (également appelé HOIL-1) code une ligase E3 de l’ubiquitine qui constitue un composant essentiel du complexe LUBAC, en catalysant l’ubiquitination liée à Met1 (linéaire) afin de réguler les voies de signalisation NF-κB et MAPK. En assemblant des chaînes d’ubiquitine linéaires sur des intermédiaires clés de signalisation, RBCK1 contribue à coordonner les réponses immunitaires innées, la signalisation inflammatoire et les décisions de survie cellulaire en aval de récepteurs tels que TNFR et des récepteurs de reconnaissance des motifs (PRR). RBCK1 participe également aux voies de contrôle qualité des protéines et à la régulation, dépendante de l’ubiquitine, de processus liés à l’autophagie. Une perturbation ou une dysrégulation de l’activité de RBCK1 a été associée à des phénotypes d’immunodéficience et d’autoinflammation, ainsi qu’à des manifestations myopathiques et cardiomyopathiques, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques de l’homéostasie immunitaire et des réponses au stress.

RBCK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RBCK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RBCK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RBCK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RBCK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RBCK1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RBCK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RBCK1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RBCK1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RBCK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.