RasGRP2 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m): sc-422598

Übersicht

Rasgrp2 kodiert RasGRP2 (auch als CalDAG-GEF1 bekannt), einen durch Calcium und Diacylglycerol regulierten Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, der Rap1 und verwandte kleine GTPasen aktiviert. In Mauszellen verknüpft RasGRP2 die intrazelluläre Second-Messenger-Signalübertragung mit der Inside-out-Aktivierung von Integrinen und koordiniert dadurch Zelladhäsion, Ausbreitung und Zytoskelett-Umbau. Dieser Signalknoten ist an Programmen der Thrombozytenaktivierung und am Trafficking von Immunzellen beteiligt – über Signalwege, die auf eine Rap1-abhängige Kontrolle von Adhäsionsrezeptoren und nachgeschaltete MAPK-assoziierte Antworten zusammenlaufen. Eine Fehlregulation der RasGRP2-vermittelten Rap1-Signalgebung wird mit Defekten der Hämostase und veränderten zellulären Adhäsionsphänotypen in Verbindung gebracht, die für thrombose- und entzündungsbezogene Forschungsmodelle relevant sind.

RasGRP2 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des Rasgrp2-Gens in mouse-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des Rasgrp2-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.

Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.

Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter

Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das RasGRP2 HDR-Plasmid (m) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte Rasgrp2 Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem RasGRP2 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m):

• Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das Rasgrp2 offene Lesegerüst.
  Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
  Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
  Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.

Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem

Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des Rasgrp2-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:

• Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
  Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
  Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen

Hauptmerkmale

• gRNA, die auf Rasgrp2 Exon(e) abzielt, die für die RasGRP2 Funktion entscheidend sind
  Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
  HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
  loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
  Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.