Plasmide CRISPR d'Activation (h) rapsyn: sc-403991-ACT

Le gène humain **RAPSN** code la rapsyne, une protéine d’échafaudage postsynaptique essentielle au regroupement et à la stabilisation des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (AChR) à la jonction neuromusculaire. La rapsyne coordonne des interactions protéine–protéine qui organisent la membrane postsynaptique et favorise la maturation synaptique via l’ancrage des récepteurs et leur liaison au cytosquelette. La fonction de **RAPSN** s’articule avec la signalisation agrine–LRP4–MuSK et les processus d’assemblage en aval qui assurent une transmission neuromusculaire efficace. Une altération de l’activité ou de l’expression de **RAPSN** est associée aux syndromes myasthéniques congénitaux et à des troubles apparentés de la jonction neuromusculaire, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques de l’organisation synaptique.

rapsyn Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAPSN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

rapsyn Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAPSN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAPSN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de rapsyn. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAPSN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de rapsyn au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie rapsyn dans les cellules tumorales présentant une expression de RAPSN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.