Plasmide CRISPR/Cas9 KO Ran BP-2 (h): sc-401665

Présentation

RANBP2 code Ran BP-2 (Nup358), une grande nucléoporine des filaments cytoplasmiques du complexe du pore nucléaire, qui coordonne le transport nucléocytoplasmique via un trafic dépendant de la GTPase Ran. En tant que ligase SUMO E3 et protéine d’échafaudage pour les récepteurs de transport, Ran BP-2 régule la SUMOylation de cargos clés, module des processus dépendants des microtubules pendant la mitose et soutient la dynamique d’import/export des ARNm et des protéines. Elle contribue également à la signalisation de l’immunité innée en influençant la localisation de facteurs antiviraux et l’équilibre entre intermédiaires de signalisation nucléaires et cytosoliques. Des altérations de la fonction de RANBP2 ont été associées à des perturbations du transport nucléaire et des réponses au stress, et sont étudiées notamment dans des contextes de phénotypes neuro-inflammatoires et neurodégénératifs, ainsi qu’en biologie des cellules tumorales.

Le Ran BP-2 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h) est un ensemble de plasmides conçus pour la disruption ciblée du gène RANBP2 dans les lignées cellulaires human. Chaque plasmide du pool co-exprime un sgRNA unique, ciblant un site distinct au sein du locus RANBP2, ainsi que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes, et code pour la GFP afin de permettre l'identification par fluorescence et l'enrichissement des cellules transfectées avec succès. Cette stratégie multi-guide augmente la probabilité d'induire des décalages de cadre ou des délétions produisant un knock-out fonctionnel, offrant ainsi une alternative plus robuste aux approches à guide unique. Les cassures double brin (DSB) induites à plusieurs sites sont résolues par jonction non homologue (NHEJ) ou, lorsqu'elles sont utilisées avec le modèle donneur HDR inclus, par réparation dirigée par homologie (HDR) à un site cible défini au sein du locus.

Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le donneur HDR exprimant la RFP, les fluorescences GFP et RFP peuvent être utilisées conjointement pour distinguer les populations de cellules transfectées de celles éditées, rationalisant ainsi les workflows de tri par cytométrie en flux et de sélection de clones.

Donneur de réparation dirigée par homologie (HDR) — Cassette de puromycine avec rapporteur RFP

Pour les applications nécessitant des clones knock-out confirmés et sélectionnables, le Ran BP-2 plasmide HDR (h) comprend une construction donneuse HDR contenant une cassette de résistance à la puromycine (PuroR) et un rapporteur protéine fluorescente rouge (RFP), flanquée de bras d'homologie spécifiques à un site cible RANBP2 défini.
Lorsqu'il est co-transfecté avec le plasmide Ran BP-2 CRISPR/Cas9 KO (h):

• La cassette PuroR-RFP s'intègre au site de coupure de Cas9 via HDR, perturbant le cadre de lecture ouvert RANBP2.
  La fluorescence RFP fournit un indicateur visuel immédiat de la réussite de l'intégration, permettant l'identification ou le tri par fluorescence des cellules éditées avant ou parallèlement à la sélection par la puromycine.
  Les cellules éditées avec succès sont confirmées par leur résistance à la puromycine, ce qui réduit considérablement la charge de criblage des clones.
  Cette stratégie de sélection est idéale pour générer des lignées cellulaires KO clonales stables destinées à des études fonctionnelles en aval, au criblage de médicaments ou au développement de modèles.

Système de suppression de la cassette Cre-lox

La construction donneuse HDR comporte des sites loxP flanquant la cassette de sélection PuroR-RFP afin de permettre une suppression propre du marqueur après confirmation du clone. L'expression transitoire de la recombinase Cre via le vecteur Cre inclus Cre Vector: sc-418923 excise la cassette, laissant un site loxP résiduel minimal au sein du locus RANBP2 et éliminant les effets de confusion potentiels sur les tests en aval.
Cette approche en deux étapes :

• Minimise la perturbation de l'architecture locale de la chromatine et des éléments régulateurs voisins
  Restaure un contexte génomique quasi-naturel au niveau du locus édité
  Permet la réutilisation de la stratégie de sélection à la puromycine dans la même lignée cellulaire pour des modifications supplémentaires

Caractéristiques principales

• gRNA ciblant le ou les exons RANBP2 essentiels à la fonction Ran BP-2
  Co-expression de SpCas9 et de sgRNA à partir d'un seul plasmide pour une administration simplifiée
  Donneur HDR avec résistance à la puromycine pour une sélection positive des clones
  Cassette PuroR flanquée de loxP avec vecteur de recombinase Cre pour une suppression transparente du marqueur
  Fourni prêt à l'emploi pour une administration par transfection

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.