Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ral BP-1: sc-402752-ACT

RALBP1 code pour Ral BP‑1 (également connu sous le nom de RLIP76), un effecteur multifonctionnel des GTPases Ral qui intègre la signalisation avec le trafic membranaire et la dynamique du cytosquelette. Ral BP‑1 participe à l’endocytose dépendante de la clathrine, à l’internalisation des récepteurs et au remodelage de l’actine via des interactions avec des adaptateurs et des voies impliquant de petites GTPases, reliant l’activité de RalA/RalB à la motilité et à des programmes cellulaires sensibles au stress. La protéine a également été associée à des fonctions de transport dépendantes de l’ATP et à des réponses de détoxification cellulaire, favorisant la survie en conditions de stress oxydatif ou xénobiotique. Une expression ou une signalisation de RALBP1 dérégulée est associée à des phénotypes de prolifération, d’invasion et de résistance aux traitements altérés dans plusieurs contextes tumoraux, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques de la signalisation oncogénique et de l’adaptation au stress cellulaire.

Ral BP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RALBP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ral BP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RALBP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RALBP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ral BP-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RALBP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ral BP-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ral BP-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RALBP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.