Plasmide CRISPR d'Activation (h) RADX: sc-409991-ACT

Le gène humain CXorf57 code RADX, un facteur se liant à l’ADN simple brin qui régule la stabilité des fourches de réplication et coordonne la réponse cellulaire au stress réplicatif. RADX contrebalance l’activité de RAD51 au niveau des fourches bloquées afin de limiter les recombinaisons aberrantes, contribuant ainsi à préserver l’intégrité du génome pendant la phase S et en conditions de dommages à l’ADN. Par ses rôles dans la réplication de l’ADN, le contrôle de la recombinaison homologue et la signalisation des points de contrôle, RADX est pertinent pour l’étude de l’instabilité chromosomique et des processus mutationnels résultant d’une protection défectueuse des fourches. Une dérégulation de la fonction de RADX a été associée à des dynamiques de réplication altérées et à des changements dans le choix des voies de réparation de l’ADN, ce qui en fait un nœud utile pour disséquer les mécanismes de maintenance du génome.

RADX Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CXorf57 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RADX Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CXorf57 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CXorf57, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RADX. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CXorf57 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RADX au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RADX dans les cellules tumorales présentant une expression de CXorf57 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.