Rad52 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401948-ACT

Human RAD52 kodiert Rad52, einen DNA-Reparaturfaktor, der homologe Rekombination und Einzelstrang-Annealing fördert, um nach Doppelstrangbrüchen die genomische Integrität wiederherzustellen. Rad52 ist an replikationsassoziierter Reparatur und am rekombinationsvermittelten Restart beteiligt und koordiniert dabei mit der DNA-Endresektion sowie RAD51-abhängigen Prozessen im Rahmen der umfassenderen DNA-Schadensantwort. Seine Aktivität beeinflusst die chromosomale Stabilität, Rekombinationsergebnisse und die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber genotoxischem Stress. Eine veränderte RAD52-Funktion oder -Abhängigkeit wurde im Kontext von Genominstabilitäts-Phänotypen untersucht, die in verschiedenen krebsassoziierten Reparatur-Hintergründen sowie in Modellen mit beeinträchtigter homologer Rekombination beobachtet werden.

Rad52 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAD52-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rad52 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAD52-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAD52-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rad52-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAD52-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rad52-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rad52-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAD52-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.