Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rad50: sc-401617-ACT

Le gène humain **RAD50** code la protéine Rad50, un composant central du complexe **MRN** (MRE11-RAD50-NBN), qui détecte les cassures double brin de l’ADN et coordonne la signalisation de la réponse aux dommages de l’ADN. Les activités ATPase et d’arrimage de Rad50 aident à rapprocher les extrémités d’ADN rompues et soutiennent la recombinaison homologue, la jonction d’extrémités non homologues, la stabilité des fourches de réplication et le maintien des télomères. Grâce à son couplage fonctionnel à l’activation du point de contrôle dépendant d’ATM et au contrôle de la résection des extrémités, **RAD50** influence l’arrêt du cycle cellulaire et les programmes de surveillance du génome. La dérégulation de l’activité du complexe MRN et les défauts de réparation de l’ADN associés à **RAD50** sont liés à des phénotypes d’instabilité génomique fréquemment étudiés en biologie du cancer et dans les maladies héréditaires de la réparation de l’ADN.

Rad50 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAD50 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rad50 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAD50 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAD50, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rad50. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAD50 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rad50 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rad50 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAD50 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.