RACK1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400800-ACT

Humanes RACK1 (Receptor for Activated C Kinase 1; GNB2L1) ist ein multifunktionales WD-Repeat-Gerüstprotein, das Signalausgänge von Proteinkinase C und anderen Signalwegen mit der ribosomenassoziierten Kontrolle der Translation integriert. Es lokalisiert zur 40S-ribosomalen Untereinheit und koordiniert die mRNA-Translation, Stressantworten und die Organisation des Zytoskeletts und beeinflusst dadurch Zelladhäsion, Migration und Proliferation. RACK1 ist an Signalnetzwerken beteiligt, die durch Wachstumsfaktoren und Integrine gekoppelt sind, einschließlich des Crosstalks zwischen MAPK- und PI3K/AKT-Signalwegen, und kann Assemblierungen von Kinasen und Phosphatasen an spezifischen subzellulären Orten modulieren. Eine fehlregulierte RACK1-Expression oder -Signalübertragung wurde in mehreren krankheitsrelevanten zellulären Kontexten mit veränderter onkogener Signalgebung, metastatischen Phänotypen und einem Umbau inflammatorischer Signalwege in Verbindung gebracht.

RACK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RACK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RACK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RACK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RACK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RACK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RACK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RACK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RACK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RACK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.