Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rac 3: sc-403445-ACT

RAC3 code Rac 3, un membre de la famille Rho des petites GTPases, qui alterne entre des états liés au GDP et au GTP afin de coordonner le remodelage du cytosquelette d’actine et la dynamique membranaire. Rac 3 participe à des réseaux de signalisation qui régulent la migration et l’adhérence cellulaires, la croissance des neurites et le trafic vésiculaire via des effecteurs en aval, notamment les kinases PAK, le complexe WAVE/Arp2/3 et des voies apparentées à la PI3K. Dans les cellules humaines, une activité altérée de RAC3 a été associée à une dérégulation du contrôle du cytosquelette et de programmes transcriptionnels influençant la prolifération et des phénotypes invasifs dans de multiples contextes pertinents pour les maladies. Ces propriétés font de RAC3 un nœud utile pour étudier les interactions entre les voies de signalisation des GTPases Rho, les signaux issus des récepteurs et les comportements cellulaires dépendants du cytosquelette.

Rac 3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAC3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rac 3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAC3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAC3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rac 3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAC3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rac 3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rac 3 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAC3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.