Rab11-FIP5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407779-ACT

RAB11FIP5 kodiert Rab11-FIP5, ein mit der Rab11-Familie interagierendes Protein, das als Effektor im Rab11-abhängigen Recyclingendosomen-Transport fungiert. Es koordiniert die Vesikelsortierung und Membranrecyclingprozesse, die den Rezeptorumsatz, die Endozytose und den polarisierten Transport beeinflussen und dadurch die Signalausgabe an der Plasmamembran prägen. Über seine Funktionen in der endosomalen Dynamik und im Cargo-Recycling trägt Rab11-FIP5 zur Regulation von Zellmigration, Adhäsion und Zytoskelettorganisation bei. Fehlregulierte Recyclingwege unter Beteiligung von Rab11-Effektoren wurden mit veränderter Signalgebung und invasiven Phänotypen in mehreren krankheitsrelevanten Modellen in Verbindung gebracht, was seinen Nutzen für Studien zu trafficking-abhängigen Mechanismen unterstreicht.

Rab11-FIP5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB11FIP5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab11-FIP5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB11FIP5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB11FIP5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab11-FIP5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB11FIP5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab11-FIP5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab11-FIP5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB11FIP5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.