Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab GDI β: sc-404136-ACT

GDI2 code pour l’inhibiteur bêta de dissociation du GDP de Rab (Rab GDIβ), une chaperonne cytosolique qui se lie aux GTPases Rab prénylées et contrôle leur extraction des membranes, leur recyclage et leur acheminement du cytosol vers les membranes. En régulant les cycles d’activation des Rab, Rab GDIβ soutient des voies de trafic vésiculaire essentielles à l’endocytose, à l’exocytose et à la dynamique des organites, notamment le transport au niveau du Golgi et des endosomes. Des altérations de l’homéostasie des GTPases Rab et du contrôle du trafic sont associées à une dérégulation de la signalisation des récepteurs, de la présentation d’antigènes et de l’adaptation métabolique, des processus fréquemment impliqués dans la biologie des cancers ainsi que des maladies neurodégénératives et inflammatoires. En tant que coordinateur central de la localisation et de la disponibilité des Rab, GDI2 est couramment étudié pour relier des défauts de trafic membranaire à des modifications en aval de la signalisation et du phénotype cellulaire.

Rab GDI β Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GDI2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab GDI β Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GDI2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GDI2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab GDI β. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GDI2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab GDI β au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab GDI β dans les cellules tumorales présentant une expression de GDI2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.