Rab 9A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416915-ACT

RAB9A kodiert Rab9A, eine kleine GTPase, die die Dynamik später Endosomen sowie den retrograden Transport von späten Endosomen zum trans-Golgi-Netzwerk reguliert. Durch die Koordination von Vesikelabschnürung, Transport und Membranfusion unterstützt Rab9A die endosomale Sortierung, die lysosomale Homöostase und das Recycling von Fracht, etwa von Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren. Diese Transportachse überschneidet sich mit Autophagie-Lysosom-Pathways und weiteren Membrantransportnetzwerken, die die zelluläre Proteostase und Signalübertragung prägen. Dysregulierter endosomaler Transport und eine veränderte Rab-GTPase-Aktivität wurden mit Mechanismen in Verbindung gebracht, die für Neurodegeneration, intrazellulären Pathogentransport und die Biologie von Krebszellen relevant sind, wodurch RAB9A ein nützlicher Knotenpunkt für mechanistische Studien ist.

Rab 9A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB9A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 9A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB9A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB9A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 9A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB9A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 9A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 9A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB9A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.