Rab 38 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404742-ACT

RAB38 kodiert Rab38, eine kleine GTPase aus der Rab-Familie, die den vesikulären Transport und die Organellbiogenese reguliert, mit wichtigen Funktionen beim Transport vom Endosom zum Lysosom und bei der Reifung lysosomenverwandter Organellen. Rab38 koordiniert die Sortierung von Frachtproteinen und die Membrandynamik durch Interaktionen mit Tethering- und Effektor-Komplexen und beeinflusst so die Proteinlieferung zu Melanosomen und anderen spezialisierten sekretorischen Kompartimenten. Störungen des RAB38-abhängigen Transports können die Bildung von Pigmentgranula, die lysosomale Funktion und sekretorische Phänotypen verändern und verknüpfen diesen Signalweg mit der zellulären Homöostase in Pigmentzellen sowie mit immunbezogenen Sekretionsprogrammen. Als Knotenpunkt in intrazellulären Transportnetzwerken ist Rab38 für mechanistische Studien von Membrantransportdefekten relevant, wie sie in unterschiedlichen krankheitsassoziierten zellulären Zuständen beobachtet werden.

Rab 38 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB38-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 38 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB38-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB38-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 38-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB38-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 38-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 38-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB38-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.