Rab 15 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-415722-ACT

RAB15 kodiert Rab15, eine kleine Ras-verwandte GTPase, die den endosomalen Membrantransport reguliert, indem sie zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen zyklisch wechselt und das Abschnüren, den Transport und die Fusion von Vesikeln koordiniert. Die Aktivität von Rab15 wurde mit der Endozytose von Rezeptoren und Sortierentscheidungen in Verbindung gebracht, die die Signalstärke und die Nährstoffaufnahme mitbestimmen, und überschneidet sich mit Rab-abhängigen Prozessen des endozytotischen Recyclings sowie der lysosomalen Zielsteuerung. Über seine Rolle in der Endosomendynamik kann Rab15 Signalwege beeinflussen, die den zellulären Stoffwechsel, die Homöostase von Membranrezeptoren und die kompartimentspezifische Signaltransduktion steuern. Eine veränderte Expression oder Funktion endozytotischer Rab-Proteine, einschließlich Rab15, wird häufig in Kontexten wie der Umprogrammierung onkogener Signalwege, der Neurobiologie und der Regulation von Immunzellen untersucht, in denen trafficking-abhängige Phänotypen besonders ausgeprägt sind.

Rab 15 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB15-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 15 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB15-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB15-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 15-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB15-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 15-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 15-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB15-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.