Plasmide CRISPR d'Activation (h) R-Spondin2: sc-402648-ACT

RSPO2 code pour R‑Spondin2, un agoniste sécrété de la signalisation Wnt canonique/β‑caténine qui amplifie l’activité des récepteurs Wnt via des interactions avec LGR4/5/6 et la modulation du renouvellement des récepteurs médié par RNF43/ZNRF3. En potentialisant les programmes transcriptionnels induits par Wnt, R‑Spondin2 influence la mise en place des patrons embryonnaires, la différenciation épithéliale et mésenchymateuse, ainsi que l’homéostasie tissulaire, avec une forte pertinence pour des processus tels que la morphogenèse, le maintien des cellules souches/progénitrices et le renouvellement des barrières. Une signalisation RSPO2 dérégulée a été associée à une activation aberrante de la voie dans des anomalies du développement et des contextes oncogéniques, ce qui en fait un nœud utile pour disséquer les réseaux de régulation génique dépendants de Wnt. Son mode d’action extracellulaire relie également RSPO2 aux études de signalisation paracrine dans des modèles d’organoïdes, de co‑culture et axés sur le microenvironnement.

R-Spondin2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RSPO2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

R-Spondin2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RSPO2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RSPO2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de R-Spondin2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RSPO2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de R-Spondin2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie R-Spondin2 dans les cellules tumorales présentant une expression de RSPO2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.